ISOLASI DNA GENOM MANUSIA DARI SAMPEL DARAH (WHOLE BLOOD) MENGGUNAKAN PROTOKOL KIT PROMEGA

TULISAN MASIH PERLU REVISI dan BELUM RAMPUNG. Silahkan mengisi komentar dan saran anda di kolom Comment.

ISOLASI DNA GENOM MANUSIA DARI SAMPEL DARAH (WHOLE BLOOD) MENGGUNAKAN PROTOKOL KIT PROMEGA
Oleh :
HERI SANTOSO (08620061) Student of Biology Departement
Faculty of Science and Technology, Maulana Malik Ibrahim State Islamic University of Malang
Cp : 085731893986, email : prof_hero89@yahoo.com


BAB I PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler (Jusuf 2001).
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Teknik melakukan Isolasi DNA Sebenarnya sangat spesifik, terdapat berbagai macam metode dan protocol yang berbeda. Sampel yang digunakan juga bervariasi, sehingga diperlukan protocol yang spesifik untuk mengisolasi DNAnya.Masing masing mempunyai prosedural yang berbeda walaupun sebenarnya konsep yang dipakai adalah sama, pada praktikum kali ini dilakukan Isolasi DNA dari sampel darah Manusia (Whole Blood) dengan menggunakan protocol Kit Promega.

1.2Rumusan Masalah
Dari Latar belakang diatas dapat dikemukakan Rumusan masalah sebagai berikut:
1.Bagaimana Konsep Teknik isolasi DNA manusia melalui sampel Darah?
2.Bagaimana Reaksi dan perubahan yang terjadi pada Isolasi DNA di setiap perlakuan dalam isolasi DNA Genom Manusia melalui smapel Darah Manusia menggunakan Protokol Kit Promega?

1.3Tujuan
1.Mengetahui Konsep dasar teknik Isolasi DNA manusia melalui sampel darah.
2.Mengetahui reaksi dan perubahan yang terjadi pada Isolasi DNA di setiap perlakuan dalm Isolasi DNA Genom Manusia Manusia melalui smapel Darah Manusia menggunakan Protokol Kit Promega.

BAB II Kajian Pustaka
2.1Teknologi Isolasi DNA melalui Sampel Darah Manusia
DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA.
DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya (Allexperts, 2008).
2.2 Konsep Dasar Isolasi DNA
Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein, mengendapkan DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan menilai kemurnian DNA. Selanjutnya dengan presitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan inti. Akhirnya DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembali endapan yang terbentuk dari larutan dapar yang mengandung suatu bahan pengawet DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baikapabila didapatkan DNA yang murni dan utuh.
Langkah pertama adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (Albert et al 2002).
2.3 Metode dan Protokol dalam Isolasi DNA Manusia
DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya dari 35 µg DNA per mL darah. Dari 150 µL sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 2,5 sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 × 106/ mL darah. Setiap sel rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini.
Pada dasarnya isolasi dan ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya.  Proses tersebut meliputi tiga tahapan, yaitu: penghancuran sel, penghilangan protein dan RNA serta pemurnian DNA.

BAB III METODE PRAKTIKUM
3.1 Alat dan bahan
3.1.1 Alat-alat
1.Tabung sampel
2.Tabung mikrosentrifuse steril spesifikasi 1,5ml (untuk 3µl sampel darah)
3.Tabung mikrosentrifuse steril spesifikasi 15 ml (untuk 3ml sampel darah)
4.Sentrifuse
5.Water Bath, 37oC
6.Vortex
7.Rak Tabung
8.Wadah limbah cair
9.Mikropipet
10.Glove dan alat sterilisasi
3.1.2 Bahan-bahan
1.Sampel darah 3 ml
2.Isopropanol suhu ruang
3.Etanol 70% suhu ruang
4.Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution)
5.Larutan pelisis bahan inti (Nuclei Lysis Solution)
6.Larutan RNase (RNase Solution)
7.Larutan Pengendap Protein (Protein precipitation)
8.Larutan Penghidrasi DNA (DNA Rehydration)
3.2 Metode
1)Diambil 3 ml sampel Darah (whole blood).
2)Dimasukkan kedalam tabung sampe 15 ml dan diinvert 5-6kali secara lembut agar mix.
3)Ditambahkan 9 ml Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution).
4)Dihomogenkan campuran dengan diinvert 2-3 kali agar mix.
5)Diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dalam incubator.
6)Disentrifuse darah yang telah lisis dengan 2.000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang.
7)Dibuang supernatan dengan tidak mengganggu pellet putih yang terlihat.
8)Divortex tabung 10-15 detik sampai sel darah putih terendapkan.
9.Ditambahkan 3 ml Larutan pelisis bahan inti (Nuclei Lysis Solution).
10.Optional, ditambahkan Larutan 15 µl RNase.
9)Ditambahkan larutan 1 ml Larutan Pengendap Protein (Protein precipitation).
10)Divorteks Larutan selama 10-20 detik.
11)Disentrifuse 2.000 rpm selama 10 menit dengan suhu ruang.
12)Diambil supernatant dan dipindahkan kedalam tabung sentrifuse steril spesifikasi 15 ml yang berisikan 3 ml isopropanol bersuhu ruang.
13)Dibuang campuran larutan secara pelan hingga terlihat endapan DNA
14)Disentrifuse 2.000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang.
15)Ditambahkan etanol 70% bersuhu ruang. Dan diinvert perlahan-lahan dengan memastikan endapan pellet berada di sisi tabung sentrifuse.
16)Diambil larutan diatas Pelet DNA secara perlahan-lahan dan dikeringkan menggunakan hair-dryer selama 10-15 menit.
17)Ditambahkan 250 µl Larutan Penghidrasi DNA (DNA Rehydration)
18)Diinkubasi DNA semalaman pada suhu ruang atau suhu 4oC.
19)Disimpan DNA pada suhu 2-8oC.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan

Diambil 3 ml sampel Darah (whole blood).
Darah berwarna merah membentuk system koloid

Dimasukkan kedalam tabung sampe 15 ml dan diinvert 5-6kali secara lembut agar mix.
 Darah terlihat lebih homogen dan tidak terjadi stratifikasi.

Ditambahkan 9 ml Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution).
 Darah masih bewarna merah dan terjadi stratifikasi kasar

Dihomogenkan campuran dengan diinvert 2-3 kali agar mix.
 Darah terlihat lebih homogen dan stratifikasi tidak jelas

Diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dalam incubator.
 Darah berwarna lebih pucat dan lebih kental

Disentrifuse darah yang telah lisis dengan 2.000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang.
 Terjadi system koloid dengan statifikasi yang angat jelas. Larutan terpisah menjadi supernatant dan pelet

Dibuang supernatan dengan tidak mengganggu pellet putih yang terlihat.
 Didapat hanya bagian pellet yang jumlahnya sedikit dan kental

Divortex tabung 10-15 detik sampai sel darah putih terendapkan.
 Sampel darah tidak berwarna merah sekali tetapi lebih terang

Ditambahkan 3 ml Larutan pelisis bahan inti (Nuclei Lysis Solution).
 Sampel lebih bening dan sedikit lebih viscous

Optional, ditambahkan Larutan 15 µl RNase.
 -
Ditambahkan larutan 1 ml Larutan Pengendap Protein (Protein precipitation).
 Sampel masih terlihat lebih bening terjadi stratifikasi kasar

Divorteks Larutan selama 10-20 detik.
 Stratifikasi semakin jelas dan bening

Disentrifuse 2.000 rpm selama 10 menit dengan suhu ruang.
Terbentuk supernatant dan pelet 

Diambil supernatan dan dipindahkan kedalam tabung sentrifuse steril spesifikasi 15 ml yang berisikan 3 ml isopropanol bersuhu ruang.
 Supernatant semakin liquid dan semakin bening

Dibuang campuran larutan secara pelan hingga terlihat endapan DNA
 Endapan yang lebih viscous dalam jumlah sedikit

Disentrifuse 2.000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang.
 Terpisahkan sisa-sisa larutan dengan DNA

Ditambahkan etanol 70% bersuhu ruang. Dan diinvert perlahan-lahan dengan memastikan endapan pellet berada di sisi tabung sentrifuse.
  Tidak terjadi perubahan yang signifikan

Diambil larutan diatas Pelet DNA secara perlahan-lahan dan dikeringkan menggunakan hair-dryer selama 10-15 menit.
 Terpisahkan campuran dan tersisakan DNA dan bersifat kental

Ditambahkan 250 µl Larutan Penghidrasi DNA (DNA Rehydration)
 Tidak terjadi perubahan dalam hal warna. DNA terisolasi
Diinkubasi DNA semalaman pada suhu ruang atau suhu 4oC.



4.2 Pembahasan
Dari penjelasan pada Tinjauan Pustaka diatas maka, dibawah ini akan dibahas persub bagian untuk menggambarkan secara umum
4.2.1Tahap Penghancuran Sel
Pada Praktikum kali ini dilakukan isolasi DNA genom Manusia dari sampel Darah menggunakan Protokol instan berupa Kit Promega. Untuk mengisolasi DNA dari darah, sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah dipisahkan kemudian ditambahkan Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution). Tatapi dalam Praktikum kali ini tidak diawali dengan pemisahan sel darah merah dan darah putih. Hal ini karena Buffer sudah bekerja langsung pada kedua jenis sel tersebut.
Larutan pelisis sel (Cell Lysis Solution) sebenarnya bersifat sama sebagai bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapat mengurangi aktivitas Dnase yang terdapat di dalam sel. Menurut Muladno (2002) Secara kimiawi penghancuran sel tersebut dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (etilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium yang mempertahankan integritas sel. Sedangkan SDS berfungsi untuk merusak membran sel. Sedangkan Proses selanjutnya dilakukan Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan kotoran yang ditimbulkan akibat pengrusakan sel, sehingga yang tertinggal hanya nukleotida (DNA dan RNA).
Hasil yang didapat dari proses ini adalah materi genetik yang tidak murni. masih bercampur dengan sisa-sisa organel sel, protein dan senyawa-senyawa metabolit lain.
4.2.2Penghilangan Protein dan RNA
Larutan RNase (RNase Solution) dan Larutan Pengendap Protein (Protein precipitation) ditambahkan dalam rangka proses Penghilangan protein dan RNA. Untuk menghilangkan protein dari larutan digunakan Larutan Pengendap Protein (Protein precipitation), yang secara kimiawi teridiri dari senyawa fenol berfungsi mengikat protein dan sebagian kecil RNA dan kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Sedangkan RNA digunakan RNase. Penambahan RNase merupakan opsi. bisa dilakukan tetapi juga bias tidak perlu dilakukan. Hal ini terkait karena kadar RNA salam sel relative sesuai kebutuhan. RNA bias jadi hanya sebagian kecil dan tidak ditranskripsikan. Sehingga tidak perlu. Namun jika sampel yang digunakan adalah berasal dari sampel kelenjar maka perlu dilakukan penambahan RNase. RNase tersebut bekerja menghentikan aktivitas RNA dan menghancurkan molekulnya.
Protein juga dapat dihilangkan dengan bantuan enzim proteinase, sedangkan RNA yang tertinggal dapat dibersihkan dengan bantuan enzim RNase hingga tinggal DNA yang terdapat di dalam larutan.  Selanjutnya DNA dicampur dengan etanol dan NaCl yang berfungsi untuk memekatkan dan memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkannya.  Endapan DNA yang tampak seperti tepung berwarna putih tersebut selanjutnya dimurnikan lagi sebelum kemudian dilarutkan dengan penambahan air atau larutan TE (Tris-EDTA). DNA yang diperoleh ini kemudian digunakan untuk berbagai analisis molekuler (Muladno, 2002).
Hasil yang didapat dari proses ini adalah materi genetik yang belum murni. masih bercampur dengan protein dan senyawa-senyawa metabolit meski dalam jumalah kecil.
4.2.3Pemurnian DNA
Pemurnian DNA merupakan metode yang harus dilakukan untuk memastikan bahwa DNA yang diisolasi tidak tercampur dengan molekul lain yang bersifat kontaminan. Pada praktikum kali ini dilakukan sentrifuse berulangserta ditambahkan larutan penghidrasi DNA
Salah satu metode yang digunakan untuk isolasi DNA adalah salting out. Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainya (Profchm, 2008).
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 µg DNA per mL darah. Dari 150 µL sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 2,5 sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 × 106/ mL darah. Setiap sel rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini.
Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein, mengendapkan DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan menilai kemurnian DNA.
BAB V PENUTUP
5.1 KESIMPULAN
Pada dasarnya isolasi dan ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya.  Proses tersebut meliputi tiga tahapan, yaitu: penghancuran sel, penghilangan protein dan RNA serta pemurnian DNA.
DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya (Allexperts, 2008).
Penggunaan Protokol Kit Promega dalam isolasi DNA Manusia terbukti lebih praktis dan menghasilkan molekul DNA dlam jumalah yang banyak.

DAFTAR PUSTAKA
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2002. Molecular Biology of the Cell. Edisi ke-4. Garland Science: New York. ISBN 0-8153-3218-1 (versi online di NCBI Bookshelf).
Allexperts. 2008. Biologi Molekuler.http://en.allexperts.com/q/ Molecular-Biology-1353/DNA-extraction-using-salting. htm
[Anonim]. 2010. Biologi Molekuler. [terhubung berkala]. http:// www. Wikimedia.org/file: biologi molekuler.[31 Mei 2010]
Budowle et al. J. Human Genetics 48:137-144 (1991).
Jusuf M. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bogor : Sagung Seto.
Kasai et al. J. Forensic Science 35:1196-1200 (1990).
Morell. Science 260:1422-1423 (4 June 1993).